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關懷生命協會 的專欄 作者：國立臺灣大學動物科學技術學系 徐濟泰教授 前言 實驗動物被使用於科學應用的用途種類繁多，但是可以簡略區分為研究、商品檢驗、生產、教學等四大類別。不論是進行那一方面的科學應用，我們必須意識到動物是會感受到疼痛、焦慮與恐懼的。即使沒有進行實驗，就連最簡單的更換飼育盒操作，就會讓大鼠心跳速率提高20-46%，血壓上升15-34%。鵝、椋鳥、鴨、母雞、麻雀，只要動到他們，血中皮質酮(緊迫指標賀爾蒙)濃度就上升100-730% (Balcombe et al., 2004)。一般習以為常的簡單實驗操作，也會對動物造成極大的壓力。例如，小鼠進行尾尖採血，血中皮質酮濃度上升595%。大鼠進行管餵，血中皮質酮濃度最高可上升596%(Balcombe et al., 2004)。
實驗動物使用於研究的替代方案 在談動物使用於研究的合理性，有必要先強調動物試驗不是萬能的。例如嚙齒類實驗動物是不是最理想的人類疾病動物模式，常常是被提出來討論的議題。主要重點是嚙齒類是跟人類是有基因表現以及生理功能的差異性存在。例如，小鼠血液的免疫細胞主要是由70-90%淋巴球與10-30%嗜中性球所組成，人類則是30-50%淋巴球與50-70%嗜中性球所組成，這些會造成小鼠的小腸發炎反應跟人類有所不同。小鼠的小腸黏膜淋巴腺體的B淋巴球組成跟人類不同，小鼠的B淋巴球具備的偵測病原菌抗原的受體跟人類不同，小鼠的B淋巴球產生的抗體IgA的型態與運作機制跟人類不同。小鼠跟人類腸道細菌相雖然都以Firmicutes 與Bacteroidetes兩大門為主，但仔細探究其細部的菌種組成卻有很大差異，而且小鼠有吞食自身糞便的習性，造就小鼠的菌相組成與菌相維持方式跟人類有很大差異(Gibbons and Spencer, 2011)。雖然以小鼠為模式進行的腸道疾病治療以及益生菌的整腸效果的研究非常繁多，但是有多少可以真正應用到人類身上？ Akhtar ( 2015) 列舉過去使用小鼠實驗模式進行中風、動脈粥樣硬化、癌症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、腦部創傷、退化性失智症、發炎反應等醫藥研究，到人類身上卻是無效的例子。並舉例FDA於2004年估計，通過臨床前試驗的藥劑，有92%無法達成上市的最後階段。Hartung (2013)舉出更新的統計資料顯示，即使有臨床前的動物實驗，仍然有95%藥劑無法達成上市的最後階段。顯然動物實驗的有效性經過多年還是沒有改進，我們需要反省是不是因為某一物種數量多、價格低以及"容易"使用，因而即使有92-95%的失敗率，也無所謂? 如果，科學界能多多研發替代方案，並且避開或解決無效動物實驗，相信不僅有助於減少活體動物的使用，有助於提升科學研究表現，更有助於為人類疾病更快速有效找到解方。醫藥的開發研究過程中，毒性試驗是非常重要的一環，但是齧齒類能夠成功預測人類毒性反應的機率只有43%，非齧齒類動物的成功率較高但也只有63% (Olson et al., 2000)。即使是與人類基因高度相近的猿猴類測試，成功率還遠低於大鼠與小鼠彼此間的預測(Bailey et al., 2015)。所以，動物實驗的缺失是不容忽視的。 過去許多年來，科學界已經累積許多人類與小鼠的基因以及疾病研究，現在已經有研究團隊開始嘗試從各種資料庫，將過去累積的資料集合起來發展虛擬人體以及虛擬小鼠的電腦模式(Land et al., 2013)。我們可以先在電腦裡進行各種虛擬測試，找到最可行的調控方案，再去進行動物實驗加以驗證，這樣可以免除許許多多的活體動物前置實驗，也可以先行比較人類與小鼠基因調控與生理反應的異同，免除許許多多的猜測與錯誤推論。 用於設計藥品結構的電腦模式(Quantitative Structure Activity Relationship; QSAR)也是很好的工具，利用分子結構和毒性的關係去模擬藥物的毒性和效力，避免平白犧牲動物，也可以節省研究資源，避免錯誤的研究方向。哈佛大學的Wyss Institute 開發出晶片卡匣式人工肺臟組織或人工腸道組織，模擬正常肺臟功能或腸道功能，這樣的工具就相當方便進行各類藥物實驗，不用直接使用活體動物進行實驗。康乃爾大學的研究者也有將十種組織的細胞分別放入晶片卡匣式的十個小室，可以同時測試十種組織細胞對同種藥物的反應(Dance, 2015)。體外細胞培養也可以做到3D立體組織模式，更接近活體動物的實際情況(Fatehullah et al., 2016)。國外有許多替代方案研發推廣的資訊中心(http://www.piscltd.org.uk/ links-resources/; http://alttox.org/resource-center/databases/; http://alttox.org/ resource-center/organizations-associations/)，收集各種實驗動物的替代方案供各界參考使用。
實驗動物使用於檢驗的替代方案 化粧品(cosmetics)包含牙膏、肥皂、洗髮精、除汗臭劑、香水、美妝用品，為了在歐盟各個會員國家有統一的管理指引，歐盟理事會在1976年訂定了第一個化粧品管理指引，明確將化粧品與醫療用品以及會嘴巴吃進、鼻子吸入、注射、埋植進人體的產品作區分，並且明定禁止添加物質(The Council of the European Communities, 1976 )。因為化粧品在使用上會接觸我們的皮膚或口腔，為了確保安全，過去在進行品質檢驗時候都會有活體動物測試的法規要求，包含口腔急毒性、皮膚與眼睛急毒性測試，建議使用的實驗動物包含大鼠與白毛色兔子(The Council of the European Communities, 1984 )。基於保護實驗動物的原則，歐盟理事會也提出指引要求如果有替代方案，就要免除使用實驗動物的使用(The Council of the European Communities, 1986 )。 因應免除實驗動物使用的指引條文，歐盟理事會在1993年提出對1976年指引的修正案，要求在1998年能夠完成不使用實驗動物於化粧品檢測(The Council of the European Communities, 1993 )。但是到了1997年，仍然沒有可行的替代方案，因此展延期限到2000年。到2000年，又展延期限到2002年。歐洲議會在2003年提出對1976年指引的第7次修正案，要求在2013年能夠達成廢止化粧品原料與成品的動物測試，以及禁止使用動物測試的化粧品原料與成品在歐盟地區進行販售(The European Parliament and the Council of the European Union, 2003)。歐洲議會在2009年決定提高法律位階，提出化粧品法規(The European Parliament and the Council of the European Union, 2009) 取代過去的1976年指引以及其所有歷年修正案。 為了謹慎起見，歐盟理事會邀集專家對化粧品檢驗的動物試驗替代方案之可行性，從毒物動力學(Toxicokinetics)、皮膚致敏性(Skin sensitization)、重複劑量毒性(Repeated dose toxicity)、致癌性(Carcinogenicity)、繁殖毒性(Reproductive toxicity)等五類檢驗進行評估(Adler et al., 2011)。 專家分組會議的結論是毒物動力學方面還缺少腎臟與膽液排出以及肺臟吸收的可行替代方案，預計還需要5-7年時間開發。皮膚致敏性方面，因為需要重複暴露於刺激源才能看到反應，已有的替代方案沒辦法進行刺激源重複暴露試驗，最樂觀預計還需要7-9年時間開發。重複劑量毒性方面，確定在2013年不可能有可行的替代方案出現，至於甚麼時候可以有相關技術，專家無法預估。致癌性方面，最好的評估方法是2年齧齒類飼養試驗，但是目前一般是採用試管試驗結合90天飼養毒性試驗來縮短檢驗時程，90天的動物飼養試驗確定在2013年不可能有可行的替代方案出現，甚麼時候可以有相關技術，專家無法預估。繁殖毒性方面，目前只有動物試驗可使用，預計還需要超過10年時間開發替代方案。 歐洲(執行)委員會跟歐洲議會與歐盟理事會溝通紀錄指出，歐盟組織了解到了2013年仍然沒有完善全套的化粧品檢驗的動物試驗替代方案可使用，只有部分替代方案可行，但是基於特殊政策考量，歐盟組織仍然決定不再展延2013年廢止化粧品原料與成品的動物測試，以及禁止使用動物測試的化粧品原料與成品在歐盟地區販售之規定(European Commission, 2013)。後續，歐洲(執行)委員會對歐洲議會與歐盟理事會報告指出，截至2015年仍然沒有完善的化粧品檢驗的動物試驗替代方案可使用，可用的替代方案是由歐盟動物試驗替代方案參比實驗室(European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing, Directorate General Joint Research Centre of the European Commission; EURL ECVAM)負責驗證與公告(European Commission, 2016)。EURL ECVAM近期年度報告所公告通過的動物試驗替代方案，包含3種皮膚侵蝕測試方法(Dermal Corrosivity Test Method)、1種皮膚刺激測試方法(Dermal Irritation Test Method)、7種眼睛毒性測試方法(Ocular Toxicity Test Method)、8種接觸性皮膚過敏測試方法(Allergic Contact Dermatitis Test Method)、3種急毒性測試方法(Acute Toxicity Test Method)、3種遺傳毒性(Genetic Toxicity Test Method)、1種致癌性(Carcinogenicity Test Method)。其中眼睛毒性測試方法包含使用屠宰場新鮮牛眼球與雞眼球為替代材料的方法，急毒性測試方法包含使用斑馬魚胚胎的方法(EURL ECVAM, 2015)。EURL ECVAM的網站(https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/)，隨時供各界查詢各種已經通過驗證以及正在進行驗證的動物試驗替代方案，以及一些正在進行研發的動物試驗替代研究案。 因為目前還沒有完整的各種類別的替代方案可以採用，所以像歐盟地區採取政策性導向的法規強制管控化粧品原料與成品，這自然會限制到一些仍需要動物試驗確認安全性的原料或產品進入歐盟市場，當然廠商可以設法只使用已知天然無毒的材料去萃取原料與製造化粧品。另一方面，在醫療使用的眾多藥品跟材料，即使歐盟地區仍沒有制定法規禁用動物試驗方法進行原料與成品安全性測試。醫藥與醫療器材廠商是以自願方式，採用幾項替代方案進行部分取代安全性測試的動物試驗。我國立法院在105年10月21日三讀通過「化粧品衛生管理條例」修正案，修改了第23-2條條文為「化粧品製造、輸入或販賣業者於國內進行化粧品或化粧品成分之安全性評估，除有下列情形之一，並經中央主管機關許可者外，不得以動物作為檢測對象：一、該成分被廣泛使用，且其功能無法以其他成分替代。二、具評估資料顯示有損害人體健康之虞，須進行動物試驗者。違反前項規定之化粧品，不得販賣。第一項以動物作為檢測對象之申請程序及其他應遵行事項之辦法，由中央主管機關定之。」，並且規定修正條文公布三年之後也就是109年開始施行。
實驗動物使用於生產的替代方案 實驗動物使用於生產的應用包含疫苗、抗體、器官移植等。疫苗生產例如將弱化的豬瘟病毒注射入兔子體內，讓兔子感染後連續繼代超過800多次輪迴之後將殘存於兔子體內的豬瘟病毒的毒性降到最低，最後犧牲兔子採下脾臟及淋巴結分離出馴化病毒做成疫苗。現在已經有使用基因轉殖方式將可以刺激豬產生抗體的E2基因透過昆蟲細胞組織培養或者直接使用基因轉殖蠶去表現抗原蛋白質製成疫苗，免除使用活體兔子製造豬瘟疫苗的需求。目前蛇毒、蠍毒、蜘蛛毒血清仍大多數使用馬匹生產，近年已經開始有科學家利用基因重組方式在體外細胞培養系統進行蛇毒、蠍毒、蜘蛛毒抗體的生產技術開發(Alvarenga et al., 2014)，將來有成熟的技術就可以免除馬匹使用。現在有使用細胞體外培養方式，可以生產人工皮膚，如此可以免除犧牲豬來取得醫療用的替代皮膚。更複雜的器官透過體外培養模式的生產技術，目前仍是科學家積極努力的目標。
實驗動物使用於教學的替代方案 我國動物保護法明文規定「高級中等以下學校不得進行主管教育行政機關所定課程綱要以外，足以使動物受傷害或死亡之教學訓練」，因此高級中等以下學校絕對是需要動物使用於教學的替代方案。但是，中華民國關懷生命協會在2016調查發現，仍有高中在社團、營隊、才藝班進行活體動物解剖，這是明顯違法行為。雖然法規沒有禁止大專院校的教學使用動物，但是有一些基礎課程例如普通動物學、生物學、解剖生理的部分教案，基本上沒有必要每一年固定犧牲一批又一批的青蛙或小鼠，只為了讓學生看到動物體內的構造以及部分器官的運作模式。現在有國際性人道教育網站例如國際人道教育聯網（International Network for Humane Education;InterNICHE），該組織致力於推廣醫學、獸醫學及生物科學之高品質且符合人道精神的教育和訓練，並且提供先進的科學教學及動物實驗替代方案，與老師合作介紹動物實驗替代教學，也支持學生自由選擇是否操作動物實驗的權力。 InterNICHE 網站上有提供世界各地販售彩色3D影音教學片的製作廠商聯絡網址以及教學片的價格與內容簡介，方便尋找教材的教學單位快速找到大鼠、青蛙、豬、牛、馬、犬、貓、人等動物的解剖彩色3D透視影音教學片，甚至還有訓練外科手術模擬肌肉皮膚與血管縫合的教學訓練模具。中華民國關懷生命協會是InterNICHE臺灣地區合作夥伴，幫忙做網站中譯，讓習慣使用中文的人士方便使用網站資源。 書面的替代性教材與供應商的資料，也可以從Jukesand Chiuia (2006)編著的540頁紙本或電子書翻閱查詢。原則上不論選擇那一種動物當為授課主體，每一種組織或器官的解剖構造幾乎都可以從影音教學片找到漂亮清楚的3D圖片重複使用。根據作者的統計，在英國因為使用替代性教材，使得教學為目的的活體動物手術操作次數從1991年的12,000次降到2001年的3,760次，10年推廣期間就減少了2/3活體動物手術操作。這一方面告訴我們，被開發出來的替代性教材確實是合用的並且有很成功的廣泛接受度，另一方面也提醒我們這種替代教材的使用需要宣傳與推廣，才會發生作用。雖然我們國內還沒有很好的替代方案平台供國人使用，但是只要我們努力尋找，還是可以找到國外很好的資訊平台可以提供有用的資訊，像是挪威的國家共識平台網站，也提供多元替代教材資料庫的查詢與連結，同一平台也提供研究與商品檢驗的替代性方案資料庫連結。
結語 尊重生命要從教育做起，從學校的教學課程安排以及尊重生命為出發點的教材使用，才有機會從小開始培養正面的尊重生命倫理觀念。再從生活層面教導民眾與製造廠商，如何避免不必要的活體動物使用於產品生產與產品檢驗。在研究層面，也要努力鼓勵使用替代性模組，甚至一起投入努力研發更多種功能性更強的替代性模組，造福後續科學應用參與者。能夠從教育與行動內化的實驗動物替代理念，才是最強而且有感染力的。
參考文獻 中華民國關懷生命協會。2016。「在教育中看見動物福祉─動物實驗替代方案」。（http://www.lca.org.tw/publish/6264） Akhtar, A. 2015. The flaws and human harms of animalexperimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics24:407–419. Alvarenga, L. M., M. Zahid, A. di Tommaso, M. O. Juste, N. Aubrey, P. Billiald and J. Muzard. 2014. Engineering venom’s toxin-neutralizing antibody fragmentsand its therapeutic potential. Toxins6:2541-2567. Bailey, J., M. Thew and M. Balls. 2015. Predicting human drug toxicity and safety via animal tests: can any one species predict drug toxicity in any other, and do monkeys help?ATLA 43:393–403. Balcombe, J. P., N. D. Barnard and C. Sandusky. 2004. Laboratory routine cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science 43:42-51. Dance, A. 2015. News Feature: Building benchtophuman models. PNAS 112:6773–6775. Fatehullah, A., S. H. Tan and N. Barker. 2016. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology 18:246-254. Gibbons, D. L. and J. Spencer. 2011.Mouse and human intestinal immunity: sameballpark, different players; different rules,same score. Mucosal Immunology 4:148-157. Hartung, T. 2013. Food for thought look back in anger–What clinical studies tell us about preclinical work. ALTEX30:275-291. Jukes, N. and M. Chiuia. 2006. From guinea pig to computer mouse alternative methods for a progressive, humane education. 2nd edition Published by the International Network for Humane Education (InterNICHE). Land, S., S. A. Niederer, W. E. Louch, O. M. Sejersted, and N. P. Smith. 2013 Integratingmulti-scale data to create a virtual physiologicalmouse heart. Interface Focus 3:20120076. (http://dx.doi.org/10.1098/rsfs.2012.0076) Olson, H., G. Betton, D. Robinson, K. Thomas, A.Monro, G. Kolaja, P. Lilly, J. Sanders, G. Sipes, W. Bracken, M. Dorato, K. Van Deun, P. Smith, B. Berger, and A. Heller. 2000. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology 32:56–67. ※以上文章純屬作者見解，非本站立場
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「超級英雄」與「超級動物英雄」：格蘭
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